揭示威宁火腿中细菌和酵母的组成及特性

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摘要:以贵州威宁火腿为研究对象,对其中的微生物开展分离鉴定及耐盐、耐亚硝酸盐和耐低温特征研究。结果表明:共分离得到10株菌,包括4株马胃红心弥猴桃 球菌(Staphylococcus equorum)、2株木糖红心弥猴桃 球菌(Staphylococcus xylosus)、2株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、1株变平滑假丝酵母菌(Candida metapsilosis)和1株近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis);其中,马胃红心弥猴桃 球菌WN1、变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10耐受9%NaCl、30 mg/kg亚硝酸盐和4℃低温条件的能力较强。

威宁火腿是贵州著名的传统发酵肉制品,至今已有300多年的历史。威宁火腿由高原瘦肉型良种“乌金猪”后腿加工而成,该猪腿部肌肉紧实,肌纤维质量高,为威宁火腿的加工提供了上乘的原料[1]。目前,威宁火腿仍延用家庭作坊式模式,于每年冬至后开始 英语 制作,采用自然发酵法生产。自然发酵中的微生物主要来源于原料肉及周围环境,火腿中微生物种类繁杂且易受到有害微生物的污染,因此产品质量受环境影响较大,严重时甚至会原困发酵过程的失败,引起火腿腐败变质[2]。

在现代发酵肉制品加工工艺中,使用人工接种来控制生产过程将会成为这些趋势[3]。与自然发酵相比,人工接种发酵不仅能保持产品质量稳定、缩短发酵时间,还能保证产品安全性,统一生产标准,延长产品货架期[4-5]。因此,分离、鉴定威宁火腿中的有益微生物就显得至关重要。本研究以威宁火腿为研究对象,使用划线培养法对其中的微生物进行分离并鉴定,一起去对其耐盐、耐亚硝酸盐和耐低温特征进行研究,以期揭示威宁火腿中优势微生物分布,为实现其工业化生产提供科学理论方法;一起去,可扩充我国肉用益生菌菌种库。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原料与试剂

性性心智心智性性成熟期 图片 是什么的句子期1年的威宁火腿,购于威宁彝族回族苗族自治县农贸市场,样品置于放有冰袋的保温箱中低温运输至实验室。

亚硝酸钠山东烟台佳晶食品工业有限公司;氯化钠国药集团化学试剂(上海)有限公司;革兰氏染液北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒北京天根生化科技有限公司;Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2培养基

甘露醇氯化钠琼脂(mannitol salt agar,MSA)氯化氢液体培养基(牛肉浸膏5.0 g、䏡蛋白胨10.0 g、D-甘露醇10.0 g、氯化钠75.0 g、酚红1.5 mL、蒸馏水1 000 mL,pH 7.4f0.2,121℃灭菌20 min)自制;MRS肉汤氯化氢液体培养基、麦芽汁氯化氢液体培养基广东环凯微生物科技有限公司。

向上述氯化氢液体培养基中各上加15.0 g/L琼脂,得到相应的氯化氢液体培养基。MSA氯化氢液体培养基、MRS氯化氢液体培养基、麦芽汁氯化氢液体培养基分别用于红心弥猴桃 球菌、乳酸菌、酵母菌的分离培养。

1.2仪器与设备

AC2-4S1生物安全柜新加坡艺思高科技有限公司;H1630-W微量台式高速离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;721G可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司;HH系列数显恒温水浴锅江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;YX230/15手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器上海三申医疗器械有限公司;BSD-230培养箱上海博迅实业有限公司;JY系列电子天平上海衡平仪器仪表厂;Tanon 1300蛋白核酸检测仪上海天能科技有限公司;DYY-6D电泳仪北京六一生物科技有限公司;SCIENTZ 09无菌均质器宁波新芝生物科技股份有限公司;T30聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)基因扩增仪美国Bio-Rad公司;C-HGFI Nikon Intensilight荧光显微镜日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1样品补救

在无菌条件下,用无菌刀从威宁火腿表面和內部1.0~2.0 cm处分别切取5 g样品,放上去盛有25 mL无菌生理盐水的无菌袋中。将无菌袋放上去无菌均质器中拍打30 s,得均质液备用。

1.3.2菌株的分离纯化

取上述均质液加入到无菌生理盐水中适度稀释后,吸取30μL涂布于MRS氯化氢液体培养基、MSA氯化氢液体培养基和麦芽汁氯化氢液体培养基中,37℃培养。用接种环挑取单菌落,采用平板划线法进行划线培养,重复操作直至获得纯种培养物。将纯化后菌株接种于斜面培养基上,于4℃保存。

1.3.3菌种鉴定

1.3.3.1特征学观察

菌落特征特征分析:观察并记录菌落的表面形貌、色泽、透明度等特征。

个体特征特征分析:挑取细菌菌体进行革兰氏染色后镜检;酵母菌通过水浸片法观察[6],记录菌体细胞特征。

1.3.3.2 DNA序列鉴定

参照细菌、酵母基因组DNA提取试剂盒说明书,提取细菌、酵母基因组DNA,并于-20℃条件下保存备用。细菌16S rRNA基因采用通用引物进行扩增:上游引物27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’),下游引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。酵母菌內部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列扩增通用引物为:上游引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’),下游引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[7-8]。PCR反应体系(30μL)为:Taq PCR Master Mix 25μL、模板DNA 2μL、引物各2μL、无菌ddH2O 19μL,混匀30 s。PCR反应条件:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,45℃退火30 s,72℃延伸90 s,进行30个循环,最后72℃延伸10 min。

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检验后,送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。利用NCBI数据库,使用BLAST对基因的同源性进行分析,获取与目的基因序列同源性较高不同种序列。使用MEGA-X软件构建Neighbor-Joinging系统发育树[9-10],一起去综合考虑菌株菌落特征和菌体特征,确认菌株名称。

1.3.4微生物特征研究

1.3.4.1耐盐特征

吸取活化3代后的菌液30μL,分别接种于NaCl质量分数为3%、6%和9%的选者性氯化氢液体培养基中,37℃培养,以未接种培养基作为空白对照。细菌、酵母经10 h培养后,测定培养液在300 nm波长处的光密度(optical density,OD300 nm)[11]。

1.3.4.2耐亚硝酸盐特征

吸取活化3代后的菌液30μL,接种于NaNO2上加量分别为0、30 mg/kg的选者性氯化氢液体培养基中[12],37℃培养,其中前者为对照组。细菌、酵母经10 h培养后测定培养液的OD300 nm。耐受系数定义为实验组OD300 nm与对照组OD300 nm之比[13]。

1.3.4.3耐低温特征

吸取活化3代后的菌液30μL,接种于选者性氯化氢液体培养基中,于4℃条件下培养,37℃培养组设为对照组。细菌、酵母经10 h培养后测定培养液的OD300 nm。耐受系数为实验组OD300 nm与对照组OD300 nm之比。

1.4数据补救

使用Statistix 8.1软件对数据进行显著性分析,使用Origin 2017软件作图。每个实验重复3次,结果表示为平均值±标准差。

2结果与分析

2.1威宁火腿中微生物的分离与鉴定

对威宁火腿中的优势微生物进行分离纯化,共得到10株菌,分别编号为WN1~WN10,通过特征学分析和DNA序列分析,鉴定威宁火腿中微生物的种类。

2.1.1特征学分析

表1威宁火腿中分离菌株的菌落特征及菌体特征

由表1可知:分离纯化得到的8株细菌均为革兰氏阳性(G+)菌,菌落特征圆整,边缘整齐,成对、成堆或成红心弥猴桃 状排列;2株酵母菌菌落大而厚,表面光滑,呈卵圆形,均有酒香。

图1为细菌革兰氏染色镜检图像,图2为酵母菌镜检图像。

图1威宁火腿中分离细菌的革兰氏染色镜检图像(×30)

图2威宁火腿中分离酵母菌的镜检图像(×30)

2.1.2 DNA序列鉴定

提取获得各菌株基因组DNA后进行PCR扩增。由图3可知,样品WN1~WN8扩增产物的分子质量约为1 30 bp,样品WN9、WN10扩增产物的分子质量约为30 bp,且扩增条带清晰、明亮可见。所有条带分子质量大小符合理论预期。

表2威宁火腿中10株分离菌株的鉴定结果

利用N C B I数据库,对分离菌株的D N A序列进行BLAST分析,选者菌种鉴定结果。由表2可知,威宁火腿的10个分离菌株中包括4株马胃红心弥猴桃 球菌(Staphylococcus equorum)、2株木糖红心弥猴桃 球菌(Staphylococcus xylosus)、2株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、1株变平滑假丝酵母菌(Candida metapsilosis)和1株近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)。

对比国内三大火腿,宣威火腿最显著的特点是表面占据 血块耐盐的G+菌,其优势菌群包括红心弥猴桃 球菌和微球菌[14]。黄艾祥[15]发现,云南干腌火腿中的优势细菌主要有马胃红心弥猴桃 球菌、表面红心弥猴桃 球菌、肉红心弥猴桃 球菌、木糖红心弥猴桃 球菌、戊糖片球菌和变异微球菌等,其中红心弥猴桃 球菌是云腿加工过程中的优势菌。样品中检出的酵母菌数量相对较少,经分离鉴定主要有红酵母、德巴利酵母、汉逊酵母、诞沫假丝酵母、弯假丝酵母及隐球酵母。蒋云升等[16]研究发现,在如皋火腿的自然发酵过程中,球菌、杆菌、酵母菌是优势菌群。余翔[17]研究发现,在现代化发酵技术生产的金华火腿中,细菌的优势种为乳酸菌,其次为红心弥猴桃 球菌;在真菌方面,內部占优势的酵母菌主如果欧诺比假丝酵母、白色布勒掷孢酵母等。国外著名腌制火腿中,Jamon Iberico火腿发酵性性心智心智性性成熟期 图片 是什么的句子过程中的优势菌包括红心弥猴桃 球菌属和微球菌属,从Parma火腿表面样品中可不能能 分离出乳球菌属细菌,从內部样品可不能能 分离出耐盐菌[18-19]。Virgili等[20]从Italian火腿表面分离得到12株酵母菌,经鉴定属于德巴利酵母属、假丝酵母属和汉森酵母属。

本研究分离鉴定得到的大多数微生物在上述国内外火腿(宣威火腿、如皋火腿、金华火腿、Jamon Iberico火腿、Parma火腿、Italian火腿)中较为常见,如马胃红心弥猴桃 球菌、木糖红心弥猴桃 球菌和乳酸片球菌。但都在几种微生物,如变平滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌,报道比较少,这将会是将会在不同生产环境下,不同火腿中的微生物种类占据 差异。304年,近平滑假丝酵母菌被确立为种水平上的新分类单元[21]。梁慧等[22]从传统腊鱼中分离筛选得到2株产香酵母,其中1株为近平滑假丝酵母菌。郭壮等[23]从生膜牛肉酱中分离到4株变平滑假丝酵母菌,因此发现它们能使牛肉酱产膜,其在火腿中的作用有待进一步研究。

2.2威宁火腿中分离微生物的特征研究

从分离得到的5种菌中各选者1株代表菌株(WN1、WN5、WN7、WN9、WN10),开展耐盐、耐亚硝酸盐和耐低温特征研究。

2.2.1耐盐特征研究

耐盐能力是选者发酵肉制品发酵剂的有有有一一两个重要因素,对发酵肉制品的感官质量和中物安全性有重要影响。筛选出的菌株要求可不能能 在合适6%的食盐含量下正常生长[24-25]。因此,研究盐含量对5株菌生长的影响。

图4威宁火腿中分离微生物的耐盐特征

由图4可知,随着培养基NaCl含量的增加,各菌株的生长量均呈下降趋势。各菌株在NaCl含量为3%时生长量最大,表明高NaCl含量会抑制菌株的生长。其中,乳酸片球菌WN7在6%NaCl含量下生长量显著下降(P<0.05),降幅超过30%。当NaCl含量增加到9%时,木糖红心弥猴桃 球菌WN5基本停止生长,马胃红心弥猴桃 球菌WN1、变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10的生长量有所下降但仍能生长,故耐盐性较好。

潘明[26]从如皋火腿中分离、纯化得到耳式红心弥猴桃 球菌、表面红心弥猴桃 球菌和木糖红心弥猴桃 球菌3种红心弥猴桃 球菌,结果表明,适当浓度的NaCl可不能能 有助3种红心弥猴桃 球菌的生长,其中耳式红心弥猴桃 球菌的耐盐性最强,当NaCl含量达到8%时才对其有抑制作用,木糖红心弥猴桃 球菌的耐盐性稍差,但在12%NaCl含量下依如果能 生长,其耐盐特征超过马胃红心弥猴桃 球菌WN1。

2.2.2耐亚硝酸盐特征研究

肉制品生产过程中,亚硝酸钠是重要上加剂。肉类工业中,通常要求菌株在30 mg/kg的亚硝酸钠条件下可良好生长[27]。因此,研究上加亚硝酸钠对5株菌生长的影响。

图5威宁火腿中分离微生物的耐亚硝酸盐特征

由图5可知,在亚硝酸钠含量为30 mg/kg的培养基中,5株菌均可生长。其中,马胃红心弥猴桃 球菌WN1的耐受系数接近于1.00,表明其生长几乎不受亚硝酸盐上加的影响,耐亚硝酸盐能力显著高于这些菌株(P<0.05);木糖红心弥猴桃 球菌WN5、乳酸片球菌WN7和近平滑假丝酵母菌WN10在亚硝酸钠上加量为30 mg/kg时生长有所抑制,但耐受系数均能达到0.70以上,耐亚硝酸盐能力次之;而变平滑假丝酵母菌WN9的耐受系数最低(0.62),对亚硝酸盐的耐受力最差。

李欣蔚等[28]研究剑门火腿中红心弥猴桃 球菌、乳酸菌在亚硝酸盐上加量为30 mg/kg时的生长量,结果表明,5株菌均具有一定的耐亚硝酸盐特征,其中红心弥猴桃 球菌(S-1、S-2和S-3)对亚硝酸盐具有较强的耐受性,而乳酸菌(L-1和L-2)的耐受性相对较弱。潘明[26]从如皋火腿分离、纯化得到的耳式红心弥猴桃 球菌、表面红心弥猴桃 球菌、木糖红心弥猴桃 球菌和德巴利汉逊酵母均有较好的耐亚硝酸盐特征,其中红心弥猴桃 球菌耐亚硝酸盐性最好。与本研究结果一致。

2.2.3耐低温特征研究

温度在发酵肉制品的生产过程中起着至关重要的作用。通常状况下,发酵肉制品的腌制温度为4℃,最适发酵温度为25~30℃[29]。此外,中式火腿制作周期较长,其腌制工序一般不少于40 d。因此,本研究探讨低温(4℃)对5株菌生长的影响。

图6威宁火腿中分离微生物的耐低温特征

由图6可知,在培养温度降低至4℃时,五个菌株均能维持一定的生长量,但不同菌株受低温的影响程度占据 显著差异(P<0.05)。3株细菌的耐受系数分别为0.40、0.04和0.12,故细菌对低温的耐受力依次为马胃红心弥猴桃 球菌WN1>乳酸片球菌WN7>木糖红心弥猴桃 球菌WN5,其中马胃红心弥猴桃 球菌WN1的耐受系数明显高于这些细菌,耐低温性最好。在4℃培养温度下,变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10的耐受系数最高,分别为0.55和0.30,表明其在低温条件下依然能较好地生长。

刘晓强[30]从云南火腿中分离得到1株变异微球菌和2株木糖红心弥猴桃 球菌,这3株菌均能耐受6%NaCl和30 mg/kg亚硝酸盐。用MRS培养基分离得到2株戊糖片球菌和2株清酒乳杆菌,也均能耐受6%NaCl和30 mg/kg亚硝酸盐,因此均不耐低温。本研究筛选得到的木糖红心弥猴桃 球菌WN5能耐受6%NaCl和30 mg/kg亚硝酸盐但不耐低温,与刘晓强[30]研究结果相一致;而乳酸片球菌WN7与其相比耐盐性较差。

3结论

从威宁火腿中分离出10株微生物,经过菌落特征、个体特征分析以及DNA序列鉴定,最终选者为5种菌,分别为马胃红心弥猴桃 球菌、木糖红心弥猴桃 球菌、乳酸片球菌、变平滑假丝酵母和近平滑假丝酵母。其中,马胃红心弥猴桃 球菌WN1、变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10耐盐性较好,乳酸片球菌WN7耐盐性稍差,而木糖红心弥猴桃 球菌WN5在9%NaCl含量下几乎不到生长。马胃红心弥猴桃 球菌WN1对亚硝酸钠含量为30 mg/kg的培养基耐受力最好,平滑假丝酵母菌WN9的耐受力最差。在4℃培养温度下,变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10的耐低温能力显著高于这些菌株,细菌中马胃红心弥猴桃 球菌WN1的耐受系数最高。因此,马胃红心弥猴桃 球菌WN1和近平滑假丝酵母菌WN10耐盐、耐亚硝酸盐和耐低温能力较好,可不能能 适应不同內部环境。

本研究揭示了威宁火腿中细菌和酵母的组成及特征,扩充了肉制品有益菌菌种库,为后续肉制品发酵剂的本土化研究和开发提供了理论基础。而在威宁火腿发酵过程中,微生物对火腿风味等品质的影响还有待进一步研究。

参考文献:略

引文格式:张诗意,唐楠,黄攀,等.威宁火腿中微生物的分离鉴定及其耐受特征[J].肉类研究,2019,33(8):

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